、目的要求
1. 掌握微生物實驗室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。
2. 掌握培養(yǎng)基的配置原則和方法。
3. 掌握高壓蒸汽滅菌器的操作方法和注意事項。
二、基本原理
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：
是種應用廣泛和普通的細菌基礎培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有般細胞生長繁殖所需要的基本的營養(yǎng)物質，所以可供細菌生長繁殖之用。
高壓蒸汽滅菌：
主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。將滅菌的物品放在高壓蒸汽滅菌鍋內，通過加熱使滅菌鍋內水沸騰而產生蒸汽。待蒸汽將鍋內冷空氣從排氣閥中趨盡，關閉排氣閥繼續(xù)加熱。此時蒸汽不溢出，壓力增大，沸點升高，獲得高于100℃的溫度導致菌體蛋白凝固變性，而達到滅菌的目的。
三、操作步驟
（）玻璃器皿的洗滌和包裝
1．玻璃器皿的洗滌
玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。
2．滅菌前玻璃器皿的包裝
（1） 培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由蓋底組成套，可用報紙將幾套培養(yǎng)皿包
成包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經滅菌之后才能使用。
（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作
用是避免外界及口中雜菌進入管內，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應距管口約0.5cm左右，棉花自身長度約1~1.5cm。塞棉花時．可用外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內。棉花要塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準。
先將報紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長條報紙的端，約成45℃角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊．在桌面上向前搓轉，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結，準備滅菌。
（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過程
1．液體培養(yǎng)基配制
（1）稱量（假定配制1000ml培養(yǎng)基）
按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取3.0g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0gNaCl放入燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。
（2）溶化
在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約700ml），用玻棒攪勻，然后，在石棉網上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積（1000ml）；如果配制固體培養(yǎng)基時，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，后補足所損失的水分。
2．固體培養(yǎng)基的配制
配制固體培養(yǎng)基時，應將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.5~2％)加
入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，后補足因蒸發(fā)而失去水分。
（三）培養(yǎng)基的分裝
根據不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內，分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時，可用鑷子夾小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。
1．試管的分裝
取個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連根橡皮管，橡皮管下端再與另玻璃管相接，橡皮管的中部加彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾佐玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1／4左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時，在瓊脂完全融化后，應趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1／5(約3—4mI)，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1／3為宜。
2．三角瓶的分裝
用于振蕩培養(yǎng)微生物時，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液體培養(yǎng)基；若用于制作 平板培養(yǎng)基用時，可在250 m1三角瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2％計算)，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。 （四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎
為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或三角瓶內空氣預行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。
蒸氣滅菌。
使用上海申安高壓滅菌器進行滅菌的過程：
1. 加水：先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面沒過加熱蛇
管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會發(fā)生燒干引起炸裂事故。
2. 裝料：放回內層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸
汽流通而影響滅菌效果。裝有培養(yǎng)基的容器放置時要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。 3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內，擺正鍋蓋，
對齊螺口，然后以對稱方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊致，勿使漏氣，并打開排氣閥。
4. 排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內的冷空氣和水蒸汽起從排
氣孔中排出。般認為當排出的氣流很強并有噓聲時，表明鍋內的空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘。
5. 升壓：冷空氣完全排盡后，關閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內壓力開始上升。 6. 保壓：當壓力表指針達到所需壓力時，控制電源，開始計時并維持壓力至所
需的時間。如本實驗中采用0.1Mpa，121.5℃，20分鐘滅菌。
滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內的冷空氣必須完全排盡后，才能關閉排氣閥，維持所需壓力。
7. 降壓：達到滅菌所需的時間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當壓力
表的壓力降至“0”后，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內剩水。壓力定要降到“0”后，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養(yǎng)基或試劑由于內外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。
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